Deteksi Bakteri dan Cendawan Patogen Benih dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction - suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik, misalnya untuk melipatgandakan suatu molekul DNA. Metode ini dapat digunakan untuk menggandakan segmen tertentu pada DNA hingga jutaan kali lipat dalam waktu relatif singkat. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 μg, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM, dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 μl (Yuwono, 2006).

Menurut Muladno (2010), PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisisnya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut sebagai forward primer dan yang berada setelah daerah target disebut reverse primer. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. 

Ekstraksi dan Deteksi Bakteri Pantoea stewartii 

Isolasi DNA bakteri. Metode PCR yang digunakan adalah PCR koloni bakteri. Koloni bakteri tunggal diambil dengan tusuk gigi kemudian disuspensikan ke dalam tabung eppendorf 1.5 ml yang berisi 500 µl H2O. Suspensi tersebut kemudian direbus pada suhu 100oC selama 10 menit. Tujuan perebusan ini adalah untuk melisis dinding sel bakteri. Hasil perebusan suspense siap digunakan sebagai templat PCR. 

Amplifikasi. Program amplifikasi terdiri atas 30 siklus dengan tahapan predenaturasi pada suhu 94oC selama 2 menit, kemudian denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 94oC selama 20 detik, suhu 58oC selama 15 detik untuk annealing (pengintegrasian primer), ekstensi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 72oC selama 90 detik, kemudian diteruskan tahap pasca extention 72oC selama 5 menit. 

Ekstraksi dan Deteksi Cendawan Fusarium sp. 

Isolasi DNA cendawan. Miselium Fusarium sp. diinokulasikan ke dalam 500 µl PDB dan diinkubasi selama 3 hari. Panen miselia dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 13 000 rpm selama 5 menit. Pellet dicuci dengan TE bufer (pH 8.0) (10mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA). Langkah ini kemudian dilanjutkan dengan penambahan 300 µl bufer ekstraksi (200 mM Tris-HCl [pH 8.5]), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA dan 0.5% SDS), digerus selama 5 menit, dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf. Hasil gerusan disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf baru dan ditambahkan isopropanol dengan volume yang sama. DNA dipresipitasi dengan sentrifugasi pada 13 000 rpm selama 10 menit. DNA dicuci dengan 500 µl Ethanol 70%, dan dilakukan brief sentrifugasi. Cairan dibuang dan pellet yang terbentuk di dasar tabung (DNA) dikeringkan dengan cara tabung eppendorf disimpan pada oven 60oC selama 5 menit. DNA yang telah terbentuk tersebut kemudian dilarutkan dengan TE (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA) dan siap digunakan sebagai cDNA untuk amplifikasi. 

Amplifikasi. Program amplifikasi terdiri atas 30 siklus dengan tahapan predenaturasi pada suhu 95oC selama 2 menit, kemudian denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 94oC selama 20 detik, suhu 58oC selama 30 detik untuk annealing (pengintegrasian primer), ekstensi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 72oC selama 1 menit, kemudian diteruskan tahap pasca extention 72oC selama 10 menit. 

Visualisasi hasil RT-PCR. Amplifikasi DNA hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis gel Agarosa 1%. Sebanyak 0,4 g Agarosa dicampur dengan 40 ml buffer TBE 0.5x dan dipanaskan hingga tercampur rata. Setelah larutan Agarosa tersebut hangat, kemudian ditambahkan Etidium Bromida sebanyak 0,5 x volume larutan per 10 ml, yaitu 2 µl. Larutan tersebut kemudian dituang ke dalam cetakan dan didiamkan selama satu jam. Setelah terbentuk gel, maka sebanyak 10 µl marker DNA dan 7 µl DNA hasil PCR dimasukkan masing-masing ke dalam sumur gel dan dilakukan elektroforesis. Elektroforesis dilakukan selama 35 menit dengan voltase sebesar 70V. DNA yang telah dielektroforesis kemudian divisualisasi di bawah UV transiluminator.

Tweet